BioTNT 生物技术服务部自从2005年成立以来，承接了超过5000个qPCR 技术服务项目，积累了广泛的qPCR 定量检测的经验。
一、荧光定量PCR概述
聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)自诞生之日起就决定了它不仅是一种高敏感、高特异的检测核酸分子的定性方法，而且也是一个能对核酸分子进行精确定量的有力工具。
随着分子生物学技术研究的不断进展，定量PCR技术取得了突飞猛进的发展，实时定量PCR (real-time quantitative PCR)技术便是一种具有革命性意义的定量PCR技术。所谓实时定量PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。
目前实时定量PCR作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域，仅 2000-2001年，收录在Medline上的以real-time PCR为关键词的文章就达1000多篇。实时PCR技术较之以前的以终点法进行定量的PCR技术具有无与伦比的优势。首先，它不仅操作简便、快速高效，而且具有很高的敏感性和特异性。其次，由于是在封闭的体系中完成扩增并进行实时测定，大大降低了污染的可能性并且无须在扩增后进行操作。
实时荧光定量PCR技术即是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号实时监测整个PCR进程，后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实 时荧光定量PCR避免了传统PCR以终产物检测定量产生的偏差，提高实验的重复性。该技术已被广泛用于检测细胞mRNA表达量的变化；比较不同组织的 mRNA表达差异；验证基因芯片，siRNA干扰的实验结果。 BioTNT为您提供全套实时荧光定量PCR技术服务，全部实验皆由BioTNT进行品质保证；实验结束后，可以提供客户完整的实验数据；并可以有一次免费的技术培训。
BioTNT mRNA QPCR 检测使用的仪器：thermofisher 的QS3
二、荧光定量化学原理介绍
采用荧光染料法； ☆SYBR Green荧光染料 SYBR Green是一种DNA结合染料，能掺入到双链DNA中去。在游离状态下，它不发出荧光，但一旦结合到双链DNA中以后，便可以发出荧光。它的大优点就是可以与任意引物、模板相配合，用于任意反应体系中。
染料结合熔解曲线来判断产物的特异性，并通过选择良好的引物并优化反应条件以消除非特异性影响。
BioTNT 使用的mix 为特异性更好的evagreen 染料，以及化学修饰法的热启动酶；
三、BioTNT QPCR mRNA检测服务样品准备
◇ 足量的并且保证纯度的细胞或组织
1、 取动物的组织，动作要求迅速，尽量避免样本在环境中暴露太久；
2、 讲样本迅速放入无菌无酶的冻存管中，为保证质量，推荐选取Axygen，corning，nunc等国外品牌的冻存管；
3、 在冻存管上做好标记，尽量清晰易辨；在实验记录本上做好记录，尽量详细易查；
4、 将冻存管直接放入液氮中速冻；或加入1ml Trizol 到冻存管中，再放入液氮速冻；
5、 速冻2h 后，将冻存管从液氮转至-80度冰箱，可以保存6个月左右；
细胞取样：
1、 悬浮细胞：500g 离心5min 取细胞，用PBS 清洗2-3遍，得细胞，并转至放入冻存管中；
2、 加入1ml Trizol 到冻存管中，吹打混匀；
3、 在冻存管上做好标记，尽量清晰易辨；在实验记录本上做好记录，尽量详细易查；
4、 将冻存管放入液氮速冻，2h 后，转至-80度冰箱，可以保存6个月左右；
尽量及早提取组织或细胞样本中的RNA并逆转录为cDNA，因为即使冻存，降解仍然存在。
样本运输：液氮运输
四、BioTNT mRNA 检测技术服务标准流程：
1、 客户提供样本（组织，细胞或者RNA)，请参照取样与保存；
2、 客户提供检测目的基因和内参基因；biotnt 提供现货引物和定制引物两种引物产品；
3、客户样本验证进行抽提，特异性逆转录，QPCR 检测，验证系统是否好用；
4. 客户的大批量样本进行处理，抽提和实验。
实验对象为组织样品，组织量不是很少的情况下，可以采用离心柱法进行抽提。取适量（10-30mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品加入裂解液，匀浆后抽提RNA。 实验对象为细胞样品，细胞数量不是很少的情况下，可以采用trizol 法进行抽提。每份样品取1×106～1×107细胞，PBS清洗细胞，去PBS加1ml的RNA抽提试剂Trizol（Invitrogen），裂解后抽提RNA。
5、 RNA 特异性逆转录得到内参CDNA， 对样本的质量进行验证；测定RNA 浓度；
6、 大批量样本real time PCR实验；使用仪器为：QS3；
7、 靶基因表达水平结果分析，数据分析方法为：delta delta CT 法；
8、 提供客户实验报告；包括方法，材料，设备，原始数据和计算数据的成套材料；
9、数据在biotnt 官网登录下载；
